研究背景：

    人脑是由数十亿个不同身份的细胞共同构建的复杂结构。而这种复杂结构是在相对均匀的神经上皮发育过程中产生的。在发育中的大脑皮层中，放射状胶质细胞 (radial glia，RG) 作为神经干细胞 (Neural stem cell，NSC)，可以自我更新并逐渐产生更多谱系限制的祖细胞，最终产生三种主要的神经谱系：神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。

    在对神经祖细胞发育过程的谱系探究中，早期研究人员可以通过不同的细胞表面蛋白标记物对神经干细胞进行流式分析分选；后来单细胞技术的出现为神经干细胞和祖细胞 (Neural stem and progenitor cells，NSPC) 在发育过程中转录组学的多样性提供了前所未有的空间和时间分辨率。但是，干细胞生物学的本质在于能够有效地分离纯细胞群以进行功能表征，就干细胞的谱系分类而言，还应该根据它们在自我更新和分化潜能方面的功能来定义。因此，我们目前对于大脑发育过程中神经干细胞和祖细胞的谱系探究还是有所限制的。特别是在人体组织中，由于难以应用遗传谱系追踪的常用工具，研究人员对人类大脑发育过程中神经干细胞和祖细胞的分化过程仍旧难以探索。

科学问题：

    如何能够有效地分离并鉴定人类大脑发育过程中的神经干细胞群以进行功能表征？

内容概述：

    作者使用高维流式细胞术与单细胞转录组学（smart-seq）相结合，对妊娠中期（GW17-19）发育中人脑的 NSC 和不同下游祖细胞亚群进行纯化分析和功能表征。在获取GW17-19 人脑组织后解剖出皮质部分，将其制备成单细胞悬液，经过多种抗体标记后进行分选。在分选过程中，作者对细胞表面的11种蛋白标记进行了测试：筛选掉非神经谱系细胞后，细胞按照5种神经干细胞特征表面标记蛋白的表达情况被索引分类到 96 孔板中，再使用 Smart-seq2 或 Smart-seq3 进行全长单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。索引分选记录了每个分选的单细胞的荧光强度，使其可以在表面标记谱和表达的转录组之间进行直接映射。之后作者对单细胞转录组进行无监督聚类分析，确定了各种假定的 NSPC 种群，结合已知的细胞表面标记以及相应的转录组分析，对各细胞群进行了注释，鉴定并纯化了十几种包括RG、星形胶质细胞、少突胶质细胞在内的细胞类型（图1）。

    除了获取这些细胞的膜表面标记物特征以及转录组特征外，作者也进行了下游功能的测定，通过高纯度的细胞群分选之后，将不同假定的细胞群分别注射到重度免疫缺陷小鼠的脑中，并且在6个月之后取样进行切片染色观察，以分析原位移植后的人源NSPC在小鼠脑发育过程中的分化特征以及迁移能力。

图1：研究流程图

    通过这种方法，作者首先对假定的NSC细胞群进行了索引分析及功能表征。假定的NSC细胞群表面识别特征为THY1-CD24-，根据联合分析，作者发现这一群细胞具有异质性，并且可根据EGFR和CXCR4的表达分为四种分化特征的细胞群。通过神经球诱导形成及体内移植的功能鉴定可知，这群假定的NSC在自我更新能力和分化潜能方面确实具有功能性；其中，EGFR的表达有促进增殖能力及促星形胶质细胞形成的作用。

    作者进一步对具有少突胶质细胞命运的细胞群及神经元细胞群进行了一系列分析及功能表征。发现在GW17-20阶段中，THY1可以作为少突胶质细胞的谱系标记物。成熟或未成熟的少突胶质细胞群均高表达THY1，并且分离纯化THY1^hi的细胞进行体内移植后，移植的细胞全部分化为少突胶质细胞。这一发现打破了之前研究者们对THY1作为神经元标记物的认知，其原因可能是新方法提高了不同细胞类型分辨率的结果。而在神经元细胞群中，根据细胞表面是否表达EGFR可以区分早期和晚期谷氨酸能神经元亚群，根据CXCR4的表达则可以区分兴奋性和抑制性的神经元类群。除此之外，假时间分析也显示mRNA的表达特征沿着神经元的成熟轨迹发生变化。

    本文中，作者除了对常见或已知的NSC类群进行分析之外，更证实了一种独特的双能神经胶质祖细胞（glial progenitor cell,GPC）的存在（图2）。在高度纯化分选的基础上，作者确认了这一单一细胞群可以在功能上分化形成星形胶质细胞和少突胶质细胞，转录组水平上也具备着独特的转录因子表达特征（ETV4），并且同时表达星形胶质细胞和少突胶质细胞的特征基因。

图2：GPC的染色鉴定

总结与启示：

    作者通过转录组学鉴定、高度纯化分离、体外克隆分化分析和体内移植结果，鉴定出了NSPC的不同表面标记特征及对应功能特性，同时为胎儿大脑中存在功能性双能GPC提供了有力的证据。除了在皮质部分的研究之外，作者也对胎儿大脑的其他区域进行了分离验证，确认了NSPC 表面标记在不同的大脑区域中的保守性（图3）。

    不过，本研究仍旧存在着一定局限，基于已有的纯化分析得到的细胞群依然存在着一定的异质性。这预示着可能存在着某些特殊标记，能够将我们目前所定义的细胞亚群进一步分类成不同阶段中的不同亚群。并且，基于表面标记而鉴定的细胞类型身份通常在空间和时间上都属于所研究的特定组织，因此在其他组织或发育阶段中进行细胞谱系分析鉴定时，此种分离策略可提供较好思路，具有一定的指导意义。

图3：研究内容概要

作者简介：

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.02.017

注：本文仅为作者个人解读，如有纰漏，请参照原文。

撰文：陈雨诺

审核：马玉乾

编辑：成美君