文献分享32：Nature | LPHN3通过可变剪接调控突触组装
研究背景：
神经元之间通过突触相互传递信息，突触可以分为电突触与化学突触。其中化学突触最为普遍，它在结构上分为突触前、突触间隙以及突触后，在突触传递过程中，突触前的囊泡与突触前膜融合，其中包含的递质被释放到突触间隙，并被突触后膜的神经递质受体结合，诱导突触后神经元的反应。突触后膜上存在着颜色较深的蛋白致密区，称为突触后致密区PSD，这一区域内实际上是由大量的突触后受体、粘附分子、突触后支架蛋白、以及各种酶组成的一个巨大的蛋白复合物，之前的研究表明，相分离机制参与到了突触后致密区的组装过程。
除了神经递质之外，突触前膜与突触后膜之间也存在着大量的跨突触分子相互作用，这些分子相互作用参与到了突触的组装以及突触功能维持的过程中，其中某些分子的缺失将会导致严重的突触功能障碍，使动物产生多种神经系统疾病。LPHN3属于突触后膜上的latrophilin家族，这一家族内有三个成员，其都属于粘附型GPCR（G蛋白偶联受体，G Protein-Coupled Receptors），粘附型GPCR与其他GPCR的不同之处在于，它存在一个巨大的胞外结构域，这个结构域常常与一些粘附分子同源，它还存在一个自水解结构域，也就是图中的GAIN domain，他可以在GPS位点将自身水解为N端片段与C端片段，其中N端片段完全处于胞外，而C端片段包含跨膜区以及胞内区。目前已知的粘附型GRCR一共有三十多个，他们的功能大部分仍然未知。
之前的工作对于相分离在突触前以及突触后的各自组装过程研究的比较多，但是对突触前与突触后之间如何相互作用研究较少。
科学问题：
突触前与突触后是如何跨突触相互作用的？LPHN3作为一种突触后的粘附型GPCR，其G蛋白信号传导的功能是什么？以及这些突触粘附分子参与突触组装调节的分子机制是什么？
研究内容：
作者首先利用大规模的RT-PCR方法发现，虽然LPHN3可变剪接的方式比较多，但主要可分为两种，第一种是包含第31个外显子的，这种剪接形式大约占60%-80%。另一种是包含第32个外显子的，这种剪接形式大约占20%-25%，并且31和32两个外显子不会出现在一种剪接体上，其主要区别在于胞内段C端的氨基酸序列存在不同。（图1）
图1：LPHN3的可变剪接类型
作者利用Rna-Seq还分析了不同类型的神经元中的LPHN3的剪接类型，发现兴奋性与抑制性神经元中的剪接类型存在较大的差异，其中区别最大的就是E31和E32的比例，在兴奋性神经元中，E32的剪接方式远高于抑制性神经元，而E31的剪接方式则相反，在抑制性神经元中E31的剪接体比例更高（图2）。作者利用TRUPATH方法（一种利用荧光和发光蛋白质之间能量转移的现象来监测蛋白质相互作用的方法）测定了不同剪接体与各自G蛋白的偶联情况，发现LPHN3与Gs的偶联最强，并且只有E24E31这种剪接体的Gs偶联比较强，而所有存在E32的剪接体与G蛋白的偶联能力均相对较弱。对Gs的下游cAMP进行进一步测定，也证明了只有含E31的剪接体能够很好的激活Gs信号通路。
图2：不同神经元类型之间LPHN3存在可变剪接的差异
为了进一步探究E31与E32两种剪接变体的功能差异，作者构建了两种LPHN3基因编辑方式，第一种方式通过敲除第七个组成型外显子，达到LPHN3无义突变的效果，而另一种则是敲除31号外显子的剪接受体，使其被剪接体切除（图3a）。通过Western Bolt以及qPCR的方法，作者发现，相比于对照组，E31KO在蛋白水平上没有明显差异，但是其中的E32剪接方式明显增加，也就是说E31KO使得LPHN3更多的产生E32剪接体（图3b, c）。 图3：两种LPHN3打靶策略
作者把两种不同的gRNA转入培养的原代海马神经元中，并利用钙离子指示剂对每一个细胞的钙活动进行监测。由于神经元之间会通过突触连接形成神经网络，因此不同神经元之间会产生比较规律的同步的自发放电行为，通过统计这种同步发放的频率以及幅值，研究者发现LPHN3KO以及E31 KO这两种突变方式都会显著降低同步发放的频率，但不影响发放的幅值。这暗示着LPHN3的可变剪接可能通过影响突触连接进而影响神经网络的强度。（图4） 图4：LPHN3可变剪接影响神经网络强度
进一步，作者使用免疫组化染色的方式统计神经元上的突触密度，利用VGluT1标记兴奋性突触前，用HOMER标记突触后，并利用MAP2标记神经纤维。通过统计单位长度神经纤维上的突触前后共标比例，作者发现E31KO与LPHN3全敲类似，都显著减少了神经元上的突触密度。说明Lphn3的可变剪接方式会影响神经元之间的突触连接（图5）。 图5：LPHN3可变剪接影响突触数量
接下来，作者希望能找到LPHN3的不同剪接体影响突触连接的分子机制。由于E31和E32这两种剪接体的区别仅在胞内段的几个氨基酸上，结构生物学手段发现E31剪接体的C端存在一个PBM基序，E32则没有，PBM基序是一个可以和PDZ结构域结合的基序，而突触后致密区的重要支架蛋白PSD95、shank3都存在PDZ结构域。张明杰院士在2018年的Cell工作中指出，突触后的几种支架蛋白可以通过相分离作用形成凝聚物，这种相分离的强度能够调控突触连接的强度，那么LPHN3是否是通过其PBM基序与这种相分离凝聚物相互作用发挥功能呢？ 作者在体外纯化了PSD95、HOMER3、SHANK3、GKAP四种突触后支架蛋白，并且加入不同剪接体的LPHN3蛋白进行了共孵育，并利用荧光标记不同蛋白分子。其中E31△PBM指的是删除了E31的PBM基序，作者发现，仅有完整的E31变体能够很好的和相分离液滴进行融合。并且LPHN3蛋白在液滴中的分布更多集中在液滴表面，这也与它们实际在突触后致密区的分布比较类似（图6f）。 进一步作者研究了LPHN3作为一种突触间的粘附分子，它与突触前配体的相互作用是否会对这种凝聚物产生的影响。作者在体系中加入LPHN3的两种突触前配体TENM2以及FLRT3，结果显示，加入突触前配体能够促进相分离颗粒之间的聚集，相比于对照组，加入两种突触前配体以及LPHN3E31剪接体的组，液滴之间能够进一步聚集形成一个大的Cluster，这暗示着突触前配体与LPHN3的相互作用有可能会影响突触后的结构以及功能（图6g）。图6h是该理论的示意图，即LPHN3通过其E31剪接体与突触后支架的相分离凝聚物相互作用，这一过程还受到突触前配体的进一步调控。 图6：LPHN3 E31与PSD凝聚物相互作用调控突触组装 总结： 作者发现突触后的粘附型GPCR分子LPHN3的存在多种可变剪接模式，其中最重要的两种分别是E31和E32类型。E31可能偶联Gs并向下游传递信号，E31还可能通过与突触后致密区的支架蛋白凝聚物相互作用，共同调控突触的组装。这一过程也会受到突触前配体的影响。而E32的作用目前仍未知晓，作者猜测可能与神经迁移或者轴突导向相关。在神经元活性增强时，E31剪接体增加，E32剪接体减少，从而增强神经元之间的突触连接。这篇工作首次报道了利用可变剪接的相互转换实现对生理功能的特异性调控，并且也是首次发现粘附GPCR通过相分离与G蛋白信号转导两种方式发挥功能，对研究可变剪接以及粘附GPCR的功能开启了一个新的方向。 作者介绍： 这篇工作的通讯作者是来自斯坦福大学的托马斯·苏德霍夫（Thomas C. Südhof）教授。苏德霍夫教授因发现囊泡的融合机制，在2013年获得了诺贝尔生理学或医学奖。近十年来，作者实验室主要研究方向聚焦在两个问题上，即突触如何在两个神经元之间建立，以及神经元如何赋予突触特定的属性。 Thomas C. Südhof 原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-023-06913-9 注：本文仅为作者个人解读，如有纰漏，请参照原文 撰文：陈治平 审核：童大力 编辑：成美君
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