研究背景：

    视网膜退化 (Retinal degeneration, RD) 是导致人类失明的主要原因之一，当前无有效的治疗方法。目前临床的治疗手段主要是延缓视网膜（Neural retina, NR）细胞的退化并保护剩余的视网膜细胞。细胞再生是治疗视网膜疾病和修复视觉的潜在手段之一，低等脊椎动物拥有视网膜再生的能力，但是人和其他哺乳动物的视网膜无法再生。部分低等脊椎动物视网膜的可再生主要依赖于其视网膜和视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE） 之间的界面存在一个特殊的圆形干细胞区域，称为睫状边缘区 (ciliary marginal zone，CMZ)，该区域内含有视网膜干细胞（Retinal stem cells, RSCs）和RPE祖细胞，具有较强的再生能力。在RScs整个寿命期间，它们持续产生新的视网膜细胞，以修复受损的视网膜。与视网膜干细胞RSCs相比，视网膜组细胞（retinal progenitor cells, RPCs）则只具有有限增殖和分化潜能。当前，视网膜干细胞是治疗视网膜退化等疾病潜在的供体细胞，但人视网膜CMZ 区内是否存在视网膜干细胞以及其细胞特征仍然未知。

科学问题：

    人睫状边缘区是否存在具有再生能力的视网膜干细胞？

内容简述：

    为了揭示人胚胎视网膜 CMZ 内的细胞类型，研究人员对21 周人胚胎视网膜的 CMZ 和 神经视网膜区域进行了单细胞多组学建库，最终鉴定出11 个主要细胞类型。其中有两个干细胞群Stem1和Stem2。Stem1表达MECOM、COL9A1等成体干细胞相关基因和CMZ相关基因ZIC1和MEIS1,所以这群细胞可能是潜在的人神经视网膜干细胞（称为 hNRSC）。Stem2表达MITF等RPE发育相关基因，但缺少成熟RPE基因表达，这群细胞可能是潜在的RPE祖细胞。为了进一步确定人CMZ 内 hNRSC 和 RPE 祖细胞的准确空间位置，研究人员对19周人胚胎视网膜进行了Stero-seq空间转录组建库。研究结果发现hNRSC位于CMZ 边缘区，该区域无色素沉积。而RPE祖细胞邻接hNRSC并连接到 RPE 层（图一）。

图一：空间转录组揭示人胚胎CMZ 中 hNRSC 的存在

    人视网膜类器官（human retinal organoids, hROs）可以模拟体内视网膜发育。研究人员发现hRO模型也会形成类似CMZ的结构，其主要位于NR和RPE的连接处，并且具有 CMZ 样结构的视网膜类器官表现出显著提升的存活率。为了研究 hRO 中CMZ 区细胞的再生潜力，研究人员对VSX2-tdTomato （VSx2是视网膜组细胞标记物）标记的人胚胎干细胞进行视网膜类器官分化，并在75天后切除VSX2- tdTomato标记的NR区域，但保留CMZ用于后续培养。结果发现，NR 会在切除位置逐渐再生（图二）。这些结果表明，人视网膜类器官中的CMZ区域具有显著的再生能力。

图二：hROs 的 CMZ 介导神经视网膜再生

    为了揭示hNRSC可再生的分子机制，研究人员对hRO在再生过程中的五个时间点（再生阶段第0、5、10、20和40天）进行了snRNA-seq建库，质控后得到了19,002个细胞。经过降维注释，确定了包括hNRSC和RPE样干细胞在内的10种主要细胞类型（图三）。通过Monocle3预测细胞发育轨迹，发现NR细胞会沿着hNRSCs-RPCs-PC前体(感光细胞前体细胞)-PC（感光细胞）的轨迹发育，且hNRSC的假时间显著早于其他细胞类型。在再生过程中，hNRSCs中有221个基因高表达，其中包括一些与早期视网膜发育相关的基因，如MECOM、TBX20、COL9A1等。通过CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除MECOM后，发现hRO再生受到抑制，导致再生的hRO大小减小，NR结构完整性受损，视网膜细胞类型的发育也受到阻碍。综上所述，研究结果表明hNRSCs具有再生潜力，并且MECOM在调控视网膜再生过程中起着关键作用，其敲除可影响再生过程的进行和视网膜细胞的分化。

图三：hRO视网膜再生的分子特征和相关机制

    鉴于在体外观察到的hNRSCs的再生潜力，研究人员进一步研究了从hROs的CMZ中获取的hNRSCs是否能够治疗rd10视网膜退化小鼠模型中的视网膜退化。研究人员选择去除 NR 区域再生5天后的类器官细胞，通过流式分选得到hNRSCs，然后移植到 2-4 周龄 BALB/c 裸鼠的视网膜下腔中（图四）。移植两个月后，接受 hNRSC 的受体小鼠视网膜中没有观察到眼内肿瘤。在视网膜内，移植后12周内核层的外部观察到大量的VSX2 -tdTomato 阳性移植细胞群，且其强烈表达RCVRN、CRX和NRL等感光细胞特异性标记物。移植20周后，移植细胞群会表达L/M-视蛋白或视紫红质等成熟感光细胞的特征基因以及视神经节细胞特征基因RBPMS。为了评估移植细胞和宿主细胞之间的连接性和整合性，研究人员通过带状突触蛋白 ribeye（CTBP-2）和突触前蛋白 PSD95染色，发现移植细胞与宿主细胞形成突触连接。

    为了更深入地研究移植细胞与宿主细胞是否形成功能性突触连接，研究人员对移植的 rd10 小鼠进行fERG测试。研究结果发现， hNRSC 移植小鼠的 b 波振幅较对照组显著升高。利用视动反应实验发现hNRSC 移植小鼠的光反应能力增强。这些结果表明，移植的 hNRSC 不仅存活并分化为视网膜细胞，而且还与 rd10 小鼠的宿主视网膜细胞整合并形成功能连接。

图四：通过移植hNRSCs实现在体视网膜功能修复

总结展望：

    研究人员对人胚胎视网膜进行了单细胞多组学和空间转录组学建库，发现了一种不同于RPE祖细胞和传统的视网膜祖细胞的新细胞亚群，即人神经视网膜干细胞（hNRSC）。这些 hNRSC 位于睫状边缘区的周边视网膜内，它们具有强大的自我更新和分化潜力。研究人员对人视网膜类器官进行了单细胞和空间转录组分析，发现 hRO内也存在与人胚胎视网膜相似的 hNRSC，能够再生视网膜细胞。将 hRO中的 hNRSC 移植到rd10小鼠中，可以显著修复退化的视网膜并恢复视觉功能。该工作鉴定并表征了来自人类视网膜的一类独特的视网膜干细胞，其具有强大的再生潜力和移植治疗的前景。

研究人员介绍：

苏建中

温州医科大学生物医学大数据研究所所长

组学数据驱动的肿瘤和眼部疾病相关研究

通过高通量测序实验与类器官模型相结合

揭示疾病中遗传和表观遗传失调的复杂性