研究背景：

    RNA 转录本的空间排列对于揭示细胞或亚细胞水平的生物相互作用至关重要，可以揭示不同组织中的不同异质性和结构组成。虽然许多空间转录组学技术依赖于表面条形码 RNA 捕获和高通量测序，但基于成像的方法，特别是原位杂交 (ISH)或原位测序 (ISS)等技术，具有卓越的空间分辨率，实现了单分子可检测性。而为了解析更多更全面的空间基因表达信息，获得可靠检测信号，势必需要对检测技术和方法进行优化。为了实现对单分子荧光杂交信号的放大，滚环扩增成为了原位杂交检测的常用手段，可以对待检测区域进行百倍以上的信号放大，而为了实现对同一样本更多基因的探测，有许多技术会采用灌流成像的方式，通过对荧光探针的结合与洗脱，进行同一样本的多轮成像，从而实现理论上数量无上限的基因检测能力。但是灌流成像的方式需要平台基础，多轮成像也会对样本造成一定程度的损伤，依靠叠加轮次来实现的通量所需要的检测时间也较长，成像成本较高。因此，是否存在一种新的方式，可以在单轮成像的技术中，实现尽可能多且尽可能真实的荧光杂交信号检测呢？

科学问题：

    如何优化现有的空间原位杂交检测技术，使其能够在对组织进行单轮成像过程中实现尽量多的荧光杂交信号检测？

内容简述：

    在过往的多种空间原位杂交检测技术中，由于荧光通道数量的限制，想要获得高通量的基因检测能力，往往是通过循环染色等方式，使得有限数量的荧光通道可以编码更多的转录本信息。但是多轮实验检测往往需要依赖于复杂的仪器设备，导致这种方法通常成本高昂且比较耗时。在本文中，研究人员开发了一种PRISM的方法，在现有空间原位杂交检测技术的基础上，通过进行荧光强度与通道编码的方式，在单轮试验中可实现31种基因的同时检测。

    PRISM的实验流程较为简单，在设计了padlock probe（挂锁探针）对RNA进行结合后进行RCA（滚环）扩增，得到扩增后信号放大的DNA纳米球，再结合荧光探针进行每个基因的检测（图1A）。而荧光探针检测时用以区分不同基因的技术原理，则是基于利用半径向量代码对不同强度的4种荧光通道进行解码。研究人员采用荧光强度值作为编码内容，选取了4个荧光通道：CH1\CH1\CY3\CY5，通过采用同序列无荧光基团的次级探针进行不同比例混合的方式，调整控制每个通道的荧光强度。例如：将ATCGCTA-CH1与ATCGCTA-（无荧光基团）按照3:2的比例混合，由于两个探针将会竞争性结合，产生离散信号。此时该探针则会表现出相对值为3的CH1通道荧光强度，另外再设置其他三个通道的混合比例，那么该基因会获得独特的4个通道的不同强度荧光组成，如3-1-2-5等等（图1B）。在此基础上再对该基因的荧光信息进行拆分，就可以识别出每个基因的对应身份。

    理论上，依靠3个通道的5种组合即可实现对124个基因的检测。然而在实践中，由于多种因素干扰，很多荧光强度编码之间难以区分。并且存在一些自发荧光干扰，一些荧光通道不适用于强度编码的方式，所以在进行筛选后，研究人员对CY3通道仅使用了有或无两种荧光强度的信息进行三个通道外的单独编码。除此之外，由于不同基因的单个DNA扩增子的大小存在异质性，因此一些代码在光谱颜色空间中难以区分。例如，强度编码为020的基因就难以与030、040进行区分。所以为了提高强度编码的辨别能力，研究人员将每个通道的强度编码转为颜色空间中相应的半径向量，只有当几个通道的共同矢量间角度不同才算是有效编码。而为了保证这种编码的向量之间具有充分的分散性，研究人员选择编码空间中的平面（CH1+CH2+CH3=4）为约束条件，使得三个量化通道的强度之和为4，这样可以大量减少不同编码方式之间的串扰，达到了强度编码的最佳可区分程度。在这种设置条件下，通过3个通道的编码，我们可以获得15种编码组合，此时再加上CH4（CY3）的有或无信号（1或0），编码组合的数量可以达到30。另外CH4也可以单独用作条形码（0004），这样通过这种编码方式，我们可以在一轮实验4个荧光通道的检测范围内，同时检测并区分出31个不同的基因，大大提高了单轮成像的检测通量（图1C）。

图1. PRISM的技术原理

    在建立了这种编码方式与检测技术之后，研究人员将PRISM技术应用到了多种组织器官的检测上，分别在小鼠脑片、小鼠胚胎全身切片、肿瘤样本等组织中均验证了这种方法的有效性，在不同组织中均可以实现单轮31个基因的标记与拆分。

    为了更好地拓展PRISM的应用，除了10μm的切片组织之外，研究人员也进行了100μm的厚组织的成像处理。对于100μm的组织，研究人员在实验过程中适当延长了探针孵育时间，并且孵育方式为将组织置于溶液中摇晃孵育，除此之外，研究人员也对组织进行了RCA循环扩增后的脱脂处理，使组织更加透明化，并且在成像前，使用碘海醇溶液对组织进行折射率匹配，以确保光的深度穿透（图2A）。对于PRISM的编码方式而言，由于不同荧光通道之间是使用信号比进行编码，所以PRISM对厚组织处理过程中的信号衰减有较高的耐受性。研究人员利用30个基因的成像检测，分析了小鼠脑切片的四个主要区域：皮质、海马、下丘脑、丘脑。检测结果显示，这些区域内标记基因的形态与分布和在薄组织成像实验中所观察到的基本一致（图2B）。

    接下来，研究人员对成像数据中每个ROI内的细胞进行3D细胞分割和分类，并与 Leiden 细胞聚类相结合，从而将神经胶质细胞和神经元分化为亚型（图 2C-D）。这些分类与单细胞转录组数据高度相关，证明了PRISM方法的稳健性。然后研究人员将细胞投影回其原始位置，构建出了 3D 神经元结构景观（图 2E）。除了细胞分析之外，研究人员也深入研究了亚细胞 RNA 分布，通过计算每个基因 RNA 质心到细胞质心的平均距离来评估每种细胞类型内的 RNA 极性。经过分析发现，不同神经元之间 RNA 极性具有显著异质性，而同种神经元在不同脑区也存在极性的显著差异，提示了大脑中不同区域内不同神经元之间可能存在转录活性的差异。而这种亚细胞的RNA分布分析也为我们了解细胞类型和状态增加了另一个维度。

图2.小鼠脑组织中的三维 RNA 原位成像

总结与意义：

    通过PRISM技术，只需要进行简单的探针设计及光谱拆分，就可以实现有限荧光通道下单轮多达31种基因的同时检测，这种技术有着巨大的应用价值，真正实现了空间原位多基因检测技术的平民化！并且如果将PRISM技术与探针结合的方式进行改造，再与灌流成像平台相结合，可以将基因检测的能力再提高一个量级。

作者介绍：

    黄岩谊教授，北京大学生物医学前沿创新中心研究员，北京未来基因诊断高精尖创新中心副主任、研究员，北京大学化学学院教授，北大-清华生命科学联合中心研究员，国家杰出青年科学基金获得者。

    黄岩谊课题组主要从事单细胞分析化学、微流控技术、高通量基因组测序技术的研究，并研发新型的生命分析化学仪器。通过融合生 物技术、生物物理、计算机、分析化学等多个学科的技术进步，来实现对复杂生物体系的定量和高通量测量。在过去几年，黄岩谊课题组 着重发展了纠错编码的新型 DNA测序策略，提出了新的测序原理和提高测序原始准确率的新方法。同时，针对单细胞定量分析的新方法和新技术，包括在低拷贝数核酸检测上和在单细胞全基因组分析、全转录组分析和极少量细胞表观遗传组分析方面，实现了一系列重要技 术突破。他们在集成微流控芯片、单细胞基因组分析技术与器件、单细胞定量化学成像分析方法方面的工作，可以很好地将表现型和基因 型及其动态调控关联起来，在单细胞层次上对复杂体系进行多维度、高精度的测量分析，提供可靠数据并揭示功能相关性。

原文索引：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.29.601330v1.full#F1

注：本文仅为作者个人解读，如有纰漏，请参照原文。

撰文：陈雨诺

审稿：章梅

编辑：成美君