研究背景：

   昼夜节律影响着机体的内分泌、新陈代谢和免疫功能。它可以通过调节细胞因子的产生和运输，以及免疫细胞的成熟和组织浸润在先天免疫中发挥重要作用。在分子层面上，昼夜节律系统受到转录翻译负反馈调控。光照和进食可以调控脂肪脂质代谢的昼夜节律，包括脂肪分解、脂肪生成和产热。脂肪的分解在非活动期达到峰值，以维持体温；而脂肪的生成则在进食期达到峰值，以从饮食中摄取和储存脂质。轮班工人的昼夜节律紊乱会损害脂质平衡，增加患代谢性疾病的风险。脂肪组织具有独特的免疫环境，富含先天性 T 细胞，包括γδT 细胞、粘膜相关恒定 T细胞（MAIT）和恒定自然杀伤 T细胞（iNKT）。先前的工作发现，脂肪组织中存在产生 IL-17 的γδ T 细胞，缺乏 γδ T 细胞或 IL-17A 的小鼠易患低体温症。

科学问题：

   昼夜节律是否会影响脂肪组织中IL-17的产生进而影响代谢？

研究内容：

1. 先天性IL-17⁺ T细胞中分子钟基因的富集

   首先，作者对来自附睾脂肪组织（epiWAT）的先天性T细胞进行了单细胞RNA测序，并汇总了来自野生型小鼠的肺、脾、胸腺、皮肤和淋巴结的先天性T细胞的公开的单细胞RNA测序数据（图1a）。作者发现与 1 型先天性 T 细胞相比，17 型先天性 T 细胞中的分子钟基因表达量更丰富（图 1d）。考虑到不同数据收集样本的节律时间差异，作者比较了在相同时间点取样的先天性 T 细胞。发现17 型先天性 T 细胞的分子时钟基因表达量都较高（图 1e），其中脂肪γδ T 细胞的总体表达量最高（图 1f）。 因此，为了研究分子钟在先天性 17 型细胞中的作用，作者聚焦于脂肪γδ17 T 细胞：作者分离了24小时内的脂肪γδ17 T细胞，发现Nr1d1有很强的昼夜节律表达（图1g），并且，脂肪γδT 细胞有节律地表达 Per1，在进入小鼠暗周期时表达达到峰值，而脂肪αβT 细胞没有观察到这种情况（图 1i-k）。

图1 先天性IL-17⁺ T细胞高表达节律基因

2. 分子钟对γδIL-17A的调控

   作者观察到，脂肪 γδ17 T 细胞中IL-17A 蛋白的生成和其转录调控子 RORγt的表达都具有很强的昼夜节律（图 2a-c）。为了确定分子钟对脂肪γδ17T 细胞表达 IL-17A 的影响，作者使用了 SR9009（分子钟转录抑制子REV-ERBα 的激动剂），通过竞争 DNA 结合位点从而抑制 RORγt所介导的转录。结果显示，SR9009施加后完全抑制了脂肪γδ17 T 细胞表达 IL-17A 和 IL-17F（图 2f-i），从而证实了分子钟对于IL-17A的调控作用。为了进一步研究分子钟在 IL-17A 表达中的作用，作者在表达 CD45 的细胞中特异性地敲除分子钟基因Arntl（Arntl∆Vav1小鼠）。结果表明，Arntl的缺失会降低肠系膜脂肪组织（mesWAT）和外周淋巴细胞（epiWAT）中γδ T细胞的百分比和数量（图 2j-k），增加脂肪 IL-17A⁺γδ T 细胞的比例和数量（图 2m-o），但对脂肪 αβ T 细胞中 IL-17A 或 IFNγ 的表达没有影响（图 2p-q）。这些结果提示了分子钟是 IL-17A 和 IL-17F 的一个主要调节因子，其中 Rev-erba（Nr1d1）的激活会降低 IL-17的表达，而 Bmal1（Arntl）的缺失会增加 IL-17的表达。

图2 脂肪 γδ T 细胞的 IL-17A 表达受节律基因调节

3. 调节γδIL-17A的环境因素

   光是对机体代谢节律进行调节的主要环境信息之一。因此，在脂肪γδT细胞对IL-17A的节律性生成中，光可能作为一种环境信号起到了诱发的作用。为了验证这个猜测，作者通过使用代谢笼，将小鼠饲养在正常光照条件下（7:00-19:00 开灯；对照组）或光-暗逆转周期下（19:00-07:00 开灯，持续三周，图 3a）。 三周后，能量消耗和新陈代谢率节律完全逆转（图 3b-d）。脂肪γδ17 T细胞产生的IL-17A具有昼夜节律，而光照反转组的这一节律被逆转（图 3g）。这表明，光作为一种环境信号可以诱导脂肪γδ17 T细胞产生IL-17A。

   随后，作者还研究了光照周期中不同时间限制喂食对脂肪 IL-17A节律的影响。作者将小鼠放入正常光照条件下的代谢笼中，但限制进食时间，于07:00-19:00 （正常）或 19:00-07:00（反向）获取食物，持续三周（图 3h）。结果显示，反向喂食小鼠的能量消耗和代谢率节律并没有完全逆转，而是被打乱（图 3i-k），其脂肪γδ17 T 细胞对 IL-17A 的昼夜节律表达也被打乱，振幅减小，相位改变（图 3n），该结果提示了脂肪 IL-17与进食密切相关。光诱发脂肪γδ17 T细胞产生IL-17A可能是由于其对进食行为产生影响而作用的。

图3 光环境调控脂肪 γδ T 细胞的全身代谢和 IL-17A 产生

4. γδIL-17A对DNL的调节

   脂肪γδT细胞是脂肪组织中IL-17A的主要来源，占脂肪组织中IL-17A的75%（图4）。 脂肪γδT细胞的缺失降低了IL-17A蛋白的水平，而在γδT细胞重新输注后，IL-17A蛋白的水平便可以恢复（图4b）。 利用 IL-17A-GFP 小鼠，作者发现 IL-17A 在所有脂肪分布区都有昼夜表达，包括 BAT、epi-WAT 和皮下脂肪组织（scWAT），其表达在夜间活动期达到峰值（图 4c）。先前的研究表明，γδ17 T 细胞在维持体温和产热方面起着关键作用。脂肪分解和脂肪生成受严格的昼夜节律控制：在小鼠中，脂肪分解发生在白天，脂肪生成发生在夜间。 通过观测脂肪 IL-17A 的表达变化，作者发现当脂肪生成（De Novo Lipogenesis，DNL）达到峰值时，IL-17 也达到峰值（图 4d）。由于脂肪 IL-17 受进食的影响，作者推测脂肪 IL-17A 可能在 DNL 中发挥作用（图 4e）。

   利用公开的 BAT 蛋白质组数据库 OPABAT，作者发现 IL-17RC 蛋白的水平与 DNL 蛋白 FASN、ACACA、ACACB、ACLY 和 SCD1 的丰度直接相关（图 4f、g）。 通过分离缺乏γδ T 细胞的小鼠（Tcrδ-/-小鼠）24 小时内的脂肪组织，发现与野生型对照组相比，Tcrδ-/-小鼠中 DNL 基因 Fasn、Acc2（又称 Acacb）和 Scd1 的昼夜节律表达被破坏（图 4h-i）。

图4 γδ T 细胞是脂肪组织 IL-17A 的主要来源，并维持脂肪组织脂质新生

   为了研究IL-17A对DNL的直接作用，作者用rIL-17A （重组IL-17A）处理原代棕色脂肪细胞，发现 rIL-17A 增加了 DNL 基因转录调节因子 Mlxipl 和脂肪酸合成酶 Fasn 的表达（图 5a-b）。 在体给予三天的 IL-17A后的结果显示，所有 BAT DNL 基因（Mlxipl、Acaca、Fasn、Scd1、Scd2 和 Elovl6；图 5c）的表达都有增加。这些结果都表明γδT细胞生成的 IL-17 对DNL的调节作用。

5. IL-17A 信号传导是脂肪细胞脂质新生（DNL）所必需的

   由于之前观察到，Arntl∆Il7r小鼠脂肪 γδ T细胞中IL-17A的表达增加，因此作者推测DNL基因的表达也会有相应增加。的确，作者Acly、Acaca 和 Scd1 在 Arntl∆Il7r 小鼠的 BAT 中的表达增加了，特别是在 ZT18 阶段，而不是在 ZT6 阶段（图 5e）。 先前的研究表明，Il17a-/- 和 Il17f-/- 小鼠的产热功能受损。 作者使用了 IL-17A 和 IL-17F 双基因敲除小鼠（Il17a/f-/-）。作者比较了野生型和Il17a/f-/- 小鼠在 ZT6 和 ZT18（分别处于非活动期和活动期的中期）时段中DNL基因表达情况，发现ZT18时Il17a/f-/-小鼠的DNL基因表达低，ZT6时没有差异（图 5g）。

   在蛋白质水平上，与野生型对照相比，Il17a-/-小鼠中 SCD1 的昼夜节律表达被破坏（图 5h）。与野生型相比，Il17a/f-/-BAT 中的脂质合成减少，但在肝脏中没有显着差异（图 5i-k）。由于 IL-17 缺陷小鼠的 BAT 中 DNL 降低，作者将野生型和 Il17a/f-/-小鼠置于促进 DNL 的为期三周的高蔗糖方案中，发现 Il17a/f-/-小鼠对高蔗糖诱导的体重增加具有抵抗力（图 5l）。

   最后，作者在热中性 （30 °C） 下对野生型和 Il17a/f-/-小鼠进行了全身代谢分析(选择热中性是为了消除适应性产热的任何影响，因为在室温下饲养的小鼠会消耗大约 40% 的能量来在室温下取暖)。之前的研究表明，BAT DNL 对于维持小鼠的体温至关重要。作者发现 Il17a/f-/-小鼠的 RER 发生了变化，尤其是在夜间（图 5o）。Il17a/f-/-小鼠的体温在一天中的任何时候都降低，尤其是在活跃期（图 5r-s）。昼夜节律分析发现，Il17a/f-/-小鼠在 24 小时内体温的昼夜节律波动显着减弱（图 5s）。上述结果表明来源于脂肪γδ T细胞的昼夜节律性IL-17A对于生理性的全身代谢和体温调节具有重要作用，并且其作用靶点是脂肪组织的DNL（脂质新生）通路。

图5 IL-17A 是脂肪细胞脂质新生（DNL）和全身代谢所必需的

总结：

该研究揭示了γδ17 T细胞中分子钟基因的富集现象以及分子钟对于IL-17A 的节律性表达所起到的调节作用，发现并证实了IL-17A/F通过调节脂肪组织的DNL通路，进而起到维持正常的生理代谢和体温的作用。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08131-3

注：本文仅为作者个人解读，如有纰漏，请参照原文

撰文：赵航

审稿：李钟

编辑：成美君